Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho

Objetivo: Desenvolver as técnicas básicas de semeadura de material para isolamento de germes

Princípio: Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para então classificá-los e caracterizá-los. Os microrganismos na natureza normalmente existem em culturas mistas, com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente. Ao determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todas as células na população são idênticas no sentido de que elas se originaram de uma mesma célula parental. Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários fatores :

• Considerações sobre a origem do material a ser analisado
• A espécie que se imagina estar presente nesta amostra
• As necessidades nutricionais dos organismos

 Material: Alça de platina, meio sólido em placa (ágar Mueller-Hinton, ágar sangue, EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de 1ml,  tubos com 4,5ml de salina estéril, alça de Drigalsky, bico de Bunsen, swab estéril, galeria para tubos de ensaio, placas de Petri estéreis, becker de 100ml com álcool, estufa a 37ºC, banho-maria a 100ºC, material biológico (saliva, sec. nasal, sec.ouvido, sec.orofaringe,  fezes, urina, etc.)

 Métodos:

Técnica de Esgotamento: A mais utilizada para isolamento de germes em meio sólido (ágar sangue, ágar EMB, etc ), onde se utiliza uma alça de platina, previamente flambada e esfriada

•  Com a alça de platina, tocar suavemente na amostra.
• Passar a alça sobre o meio de cultura em movimento de zigue-zague sem sobrepor as linha e sem recarregar a Alça[1].
• Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas

Espalhamento “Pour Plate”: Consiste em fazer uma prévia diluição da amostra e colocar em uma placa de Petri vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para homogeneizar a amostra diluída com o meio de cultura. Técnica:

• Fazer diluição seriada da amostra, ex. 1/10, 1/100 e 1/1000.
• Colocar 1 ml de cada diluição em uma placa de Petri estéril
• Fundir 10 ml de meio sólido e refriar a 65ºC
• Derramar sobre a amostra na placa e aplicar movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;
• Esperar o meio solidificar novamente e incubar  as placas a 37ºC por 24 a 48 horas

 Espalhamento Pós Plate: Consiste em espalhar a amostra diluída ou não sobre o meio com auxilio da alça de Drigalsky, para obter colônias isoladas.

 Resultados:  Observar as colônias isoladas, caracterizadas pela formação de pontos isolados sobre o meio de cultura, após a incubação.

 Recomendações Para Semeadura de Material Biológico

 Para execução de uma boa semeadura, certas precauções especiais devem ser observadas pelo manipulador, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no Laboratório:

• Todo processo deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
• Alça de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura;
• As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa
• Regular a entrada de ar do bico de Bunsen, para obter uma chama azul ( zona de esterilidade );
• Os tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com material a ser inoculado, deverão ser abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama do bico de Bunsen (zona estéril);
• As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen.
• As alças ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente antes e depois de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro, mantendo-as em posição vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha. Deixar esfriar nas proximidades da chama;
• Passar, ligeiramente, dentro da chama do Bico de Bunsen, imediatamente antes e depois da transferência, pipetas graduadas estéreis, pipeta Pasteur, ou alça de Drigalsky;
• Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os tubos ou frascos com culturas, incliná-los a aproximadamente em ângulo de 30º;
• No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal. Flambar também a boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios, imediatamente antes e depois da transferência;
• Nunca depositar a tampa ou tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a bancada ou mesa de trabalho;
• Descartar pipetas usadas em recipientes contendo soluções detergentes ou desinfetantes;
• Tratar de dispor o material de trabalho em posição adequada à fácil manipulação, sem riscos de acidentes ou trocas. Manter os tubos, alças e agulhas sempre na posição vertical, em suportes e estantes apropriadas;
• Identificar adequadamente o material de trabalho.

 Conservação das culturas puras

Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, é necessário manter as culturas vivas por um período de tempo com o objetivo de estudá-las. Para armazenar por um período curto, as culturas podem ser mantidas à temperatura de refrigeradores (4 a 10 ^oC); Para armazenar por um período longo, as culturas são mantidas em nitrogênio líquido (-196 ^oC) ou em freezers (-70 a -120 ^oC), ou ainda congeladas, e então desidratadas e fechadas à vácuo em um processo denominado liofilização

Alguns dos mais usados métodos de conservação:

• Transferência periódica para meios novos
• Sob camada de óleo mineral
• Liofilização
• Congelamento

As coleções de culturas são bancos de microrganismos e outras células que estão à disposição de pesquisadores, professores, investigadores de patentes, e todo aquele que necessite estudar um tipo particular de microrganismos - um conjunto de células de referência de uma coleção de cultura padrão. As células são congeladas em cubas de nitrogênio líquido ou liofilizadas para resistir a qualquer variação que possa destruir a identidade da célula original.

QUESTÕES

1. O que significa semear um material clinica?
2. Qual  principio das técnicas de semeadura?
3. O que significa repicar uma cultura?
4. Como se obtém uma cultura pura.
5. Qual importância da cultura pura no diagnóstico de doenças infecciosas?
6. Para se identificar uma bactéria é necessário se obter uma cultura pura. Por que uma cultura mista conduz a erros de identificação?
7. Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários fatores. Cite-os.
8. Por que todo processo de semeadura deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
9. As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa. O que pode ocorrer com as colônias se as placas forem incubadas com a tampa para cima?
10. Comente sobre os seguintes métodos de conservação de bactérias: a) Liofilização, b) Congelamento, c) Transferência periódica para novos meios, d) conservação sob camada de óleo mineral